La PCR Digital, un nuevo aliado en la detección del brettanomyces

La presencia de la levadura Brettanomyces bruxellensis en el vino es una preocupación constante en la industria vinícola por su capacidad de producir fenoles volátiles, compuestos que alteran el perfil sensorial del vino y lo hacen menos aceptable para los consumidores. Por ello, un análisis temprano y preciso es fundamental para detectar su presencia en las uvas y a lo largo del proceso de vinificación, con el fin de prevenir su desarrollo y minimizar los riesgos de contaminación.

Antonio Tomás Palacios García y Eduardo Leiva Rebollar, del Laboratorio Excell Ibérica, aportan en su análisis datos que respaldan la importancia de estos controles. A la primera pregunta sobre si Brettanomyces está presente en las uvas, la respuesta es clara: sí. Numerosos estudios realizados en las últimas dos décadas han demostrado que es posible detectar células de Brettanomyces bruxellensis en la superficie de las uvas del viñedo. Para llevar a cabo esta detección se utilizan métodos tradicionales de microbiología, como medios de enriquecimiento que facilitan su crecimiento, o técnicas más avanzadas y específicas como la PCR digital.

Sin embargo, la segunda pregunta, que se refiere a si las cepas presentes en las uvas son las mismas que contaminan el vino durante su crianza en la bodega, presenta una respuesta más compleja. Según los estudios disponibles, las cepas de Brettanomyces en las uvas no suelen ser las responsables directas de la contaminación por fenoles volátiles en el vino terminado. Más bien, estas cepas actúan de manera activa durante las etapas iniciales de la vinificación, pero otras cepas propias de la bodega suelen hacerse predominantes durante la crianza.

Por esta razón, el análisis de Brettanomyces en las bayas sigue siendo relevante, ya que la presencia de esta levadura en la superficie de la uva podría indicar un entorno favorable para su crecimiento durante las siguientes etapas del proceso. Si las uvas tienen Brettanomyces, es posible que la matriz fermentativa ofrezca condiciones más propicias para que otras cepas, más adaptadas al entorno de la bodega, se desarrollen posteriormente.

El Laboratorio Excell Ibérica ha recopilado una amplia base de datos sobre la presencia de Brettanomyces en uvas, iniciada con la tesis doctoral de Antonio Tomás Palacios durante la vendimia de 2003. Desde entonces, el laboratorio ha empleado distintas herramientas para la detección de Brettanomyces, y en 2022 introdujo la PCR digital, una técnica que es 100 veces más sensible que la PCR cuantitativa y hasta 1000 veces más precisa que las técnicas de citometría. Este avance permite detectar Brettanomyces de manera cuantitativa y sin necesidad de enriquecimiento, eliminando las limitaciones de métodos anteriores y proporcionando una estimación más exacta del número de células presentes en la muestra original.

Durante la vendimia de 2023, el laboratorio analizó más de 200 muestras de uva utilizando la PCR digital, y los resultados mostraron que un 20% de las muestras eran positivas para Brettanomyces, con una media de 10 células por cada 10 bayas. En 2024, esta tasa ha aumentado significativamente, alcanzando el 50% de las muestras analizadas hasta la fecha, aunque la media de células por baya se ha mantenido en 1 célula por baya. Esta diferencia en la recurrencia sugiere una mayor sensibilidad de las uvas de 2024 a la contaminación por Brettanomyces, lo que justifica la necesidad de un seguimiento más exhaustivo durante la vinificación.

En el mosto y el vino en fermentación, la elección del método analítico es fundamental. Muchas levaduras y bacterias coexisten en el mosto, desde Saccharomyces cerevisiae, la levadura responsable de la fermentación alcohólica, hasta levaduras no Saccharomyces como Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia, Torulaspora y Pichia. En este entorno diverso, la única forma de obtener un diagnóstico preciso es mediante técnicas que utilicen criterios genéticos específicos, como la PCR digital o la citometría con sondas genéticas. Las técnicas que se basan en características morfológicas o fisiológicas, como la citometría sin marcaje genético, tienden a sobreestimar la población real de Brettanomyces, lo que puede llevar a una interpretación incorrecta de los datos y a decisiones erróneas durante la vinificación.

En situaciones donde se emplean prácticas de vinificación arriesgadas, como la maceración prefermentativa en frío, fermentaciones con levaduras autóctonas o bajos niveles de sulfitos, el riesgo de desarrollo de Brettanomyces aumenta. Además, las uvas afectadas por Botrytis cinerea, un hongo que debilita la estructura de las bayas, son más susceptibles a la colonización por Brettanomyces, por lo que el seguimiento de estas poblaciones desde la uva hasta el vino terminado es esencial.

Otro factor relevante es la presencia de ácidos fenólicos, como el ácido cumárico y el ácido ferúlico, en las uvas y mostos. Estos compuestos, que se encuentran esterificados como ácido cutárico y fertárico, son precursores de los fenoles volátiles que Brettanomyces utiliza para su desarrollo. Los lotes de uva con concentraciones más altas de estos compuestos serán más vulnerables a la contaminación, por lo que su análisis puede proporcionar una información adicional para anticipar los riesgos.

El seguimiento temprano de Brettanomyces y el uso de metodologías analíticas específicas como la PCR digital son herramientas esenciales para mantener el control de la calidad microbiológica del vino. Los resultados de 2024 muestran una mayor frecuencia de detección en las uvas, lo que indica que se deben reforzar las medidas de prevención desde el viñedo hasta la bodega para evitar contaminaciones que puedan comprometer la calidad del producto final.