Les progrès de la génétique des levures améliorent le profil aromatique des vins blancs

Les mercaptans polyfonctionnels, tels que les thiols variétaux, jouent un rôle crucial dans le profil aromatique des vins blancs. Ces composés, liés aux arômes tropicaux et herbacés, existent dans les raisins sous forme de précurseurs non volatils. Au cours de la fermentation, les enzymes de la levure libèrent la fraction volatile, créant ainsi les arômes associés. Des facteurs tels que le cépage, les pratiques viticoles et les conditions environnementales influencent directement la disponibilité de ces précurseurs et leur transformation en arômes volatils au cours de la vinification. Le métabolisme de la levure, en particulier sa capacité à internaliser et à traiter ces précurseurs, est essentiel pour déterminer la teneur finale en thiols du vin. Les variations génétiques entre les levures et les différences dans les pratiques de vinification peuvent favoriser ou limiter la libération de ces composés aromatiques. Les stratégies biotechnologiques, telles que la sélection de souches présentant des caractéristiques génétiques spécifiques ou leur modification par des techniques d'amélioration génétique, se sont avérées efficaces pour augmenter les concentrations de thiols dans les vins. En outre, l'utilisation de consortiums microbiens et de nouvelles technologies telles que la biologie synthétique offrent des perspectives prometteuses pour améliorer la production de thiols tout en maintenant un équilibre optimal entre la capacité fermentaire et la production d'arômes. Alors que l'industrie est confrontée à des défis tels que le changement climatique et l'évolution des préférences des consommateurs, le développement de ces solutions innovantes promet des améliorations significatives de la qualité sensorielle des vins.

Les mercaptans polyfonctionnels sont des composés aromatiques sulfureux qui jouent un rôle clé dans la différenciation sensorielle des vins, principalement des vins blancs, en particulier ceux issus de variétés telles que le sauvignon blanc, le sémillon ou le verdejo. Parmi eux, les thiols variétaux contribuent de manière significative à la qualité aromatique des vins, en apportant des arômes caractéristiques de fruits tropicaux et d'herbes, ce qui en fait l'un des aspects les plus étudiés de la chimie du vin au cours des dernières décennies. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension des bases génétiques et métaboliques de la synthèse des précurseurs de thiols variétaux dans les vignes et de leur libération par les levures, de nombreuses questions restent sans réponse. L'identification des gènes responsables de la production des précurseurs de thiols dans les vignes et la régulation de leur expression en réponse à différents stimuli environnementaux sont des domaines qui nécessitent des recherches plus approfondies. En outre, l'élucidation des variations génétiques entre les différentes variétés de raisin pourrait offrir de nouveaux outils pour la sélection de cultivars ayant un meilleur potentiel de production de vins aromatiques riches en thiols.

Les principaux composés formant la fraction variétale thiolique des vins sont le 4MSP (4-méthyl-4-sulfanyl-pentan-2-one), le 3MH (3-mercaptohexan-1-ol) et son dérivé acétylé, le 3MHA (acétate de 3-mercaptohexyle), qui, en raison de leur faible seuil de perception, ont un impact sensoriel significatif sur le profil aromatique du vin. Ces thiols ne se trouvent pas sous leur forme volatile dans le raisin mais sont présents sous forme de précurseurs conjugués à des acides aminés ou à des oligopeptides (principalement la cystéine et le glutathion) qui nécessitent l'action des enzymes de la levure au cours de la fermentation pour libérer les composés volatils responsables de l'arôme. Cependant, la libération des thiols ne dépend pas uniquement de la capacité enzymatique de la levure ; elle est également influencée par la quantité et la disponibilité des précurseurs dans le moût de raisin. La disponibilité de ces précurseurs dépend du cépage, des pratiques viticoles et des conditions environnementales, ainsi que de facteurs biotiques tels que l'infection par Botrytis cinerea. Ces stimuli peuvent induire l'expression de certains gènes, augmentant l'accumulation de précurseurs de thiols dans les baies, ce qui affecte directement la capacité de la levure à libérer les thiols pendant la fermentation.

Le processus de libération des thiols pendant la fermentation dépend des levures capables d'internaliser leurs précurseurs et d'exprimer les enzymes β-lyases qui brisent les conjugués de cystéine et de glutathion, libérant ainsi les thiols volatils responsables de l'arôme du vin. Outre S. cerevisiae, d'autres espèces de levures peuvent libérer des thiols et se sont avérées utiles pour augmenter la concentration de ces composés dans le vin, soit parce qu'elles possèdent des variantes génétiques des gènes impliqués, soit parce qu'elles ont une régulation transcriptionnelle différente de celle de S. cerevisiae, soit parce qu'elles déclenchent des processus d'interaction interspécifique qui entraînent des effets synergiques entre les levures actives au cours de la fermentation. Cependant, il a été observé que, bien que les levures puissent libérer des thiols, seule une petite fraction des précurseurs présents dans le moût est effectivement transformée en composés volatils. Cela est dû en partie à la régulation complexe de l'expression des gènes impliqués dans l'internalisation des thiols et leur libération ultérieure dans les levures, ce qui souligne la nécessité de continuer à comprendre les bases moléculaires de la libération des thiols dans la vinification afin de développer des outils microbiologiques ou des itinéraires œnologiques qui maximisent leur libération.

La teneur finale en thiols du vin dépend initialement de la présence et de la concentration de leurs précurseurs dans le moût, mais le métabolisme des levures pendant la fermentation est également un aspect clé de la libération des arômes thioliques. Les levures, qu'il s'agisse de S. cerevisiae ou d'autres espèces non-Saccharomyces, internalisent les précurseurs thioliques et les hydrolysent par voie enzymatique, en utilisant l'ammonium et le pyruvate dérivés pour leur métabolisme et en libérant la fraction volatile du précurseur sous forme de thiols libres. Chez S. cerevisiae, les gènes impliqués dans ce processus sont connus. Les précurseurs thioliques sont internalisés par des transporteurs généraux d'acides aminés et d'oligopeptides. OPT1 est décrit comme le principal transporteur de précurseurs glutathionylés, tandis que le transporteur général d'acides aminés GAP1 est responsable de la majeure partie de l'internalisation des précurseurs cystéinylés. Une fois dans le cytoplasme, les enzymes à activité β-lyase rompent la liaison C-S des précurseurs cystéinylés. Les gènes BNA3, CYS3, GLO1 et surtout IRC7 codent les enzymes responsables de la libération de la 4MSP à partir de la Cys-4MSP. D'autre part, le gène STR3 a été identifié comme responsable de la libération du 3SH à partir de la Cys-3SH, bien que sa spécificité pour ce substrat soit faible. En ce qui concerne les précurseurs glutathionylés, une fois internalisés, ils se transforment en précurseurs cystéinylés par une voie vacuolaire complexe impliquant des transporteurs vacuolaires et des enzymes codées par des gènes tels que DUG1, DUG2, DUG3, ECM38, entre autres, et suivent ensuite des voies d'hydrolyse catalysées par des enzymes à activité β-lyase. Quant au thiol 3SHA, dérivé acétylé du 3SH, sa formation à partir du 3SH est catalysée par l'enzyme codée par le gène ATF1.

La connaissance des déterminants génétiques de la production de thiols chez les levures a conduit à l'exploration de variants génétiques dans les gènes impliqués dans ce métabolisme, en particulier dans le gène IRC7. Deux variants alléliques de ce gène chez S. cerevisiae ont été décrits : un variant complet (IRC7F) et un autre avec une délétion de 38 pb (IRC7S). Cette délétion modifie le cadre de lecture ouvert, générant un codon stop précoce qui produit une enzyme plus courte avec une activité catalytique plus faible. Les études ont confirmé que les souches de S. cerevisiae homozygotes pour l'allèle IRC7S ont une activité β-lyase réduite, ce qui entraîne une production faible ou nulle de thiol 4MSP. En outre, les deux études ont montré que la plupart des souches de vin de S. cerevisiae sont homozygotes pour l'allèle IRC7S supprimé. Cette situation quelque peu contre-intuitive, où le variant allélique moins fonctionnel de l'IRC7 est largement répandu dans les souches de vin, a été expliquée par l'association de l'allèle IRC7S avec des particularités phénotypiques et génomiques qui favorisent sa prévalence dans les habitats domestiqués, en particulier dans le vin.

En outre, la délétion précédemment décrite dans le gène IRC7 n'explique pas entièrement les différences d'activité enzymatique de l'Irc7p. Plusieurs polymorphismes de nucléotides simples dans la séquence IRC7 ont été identifiés, qui, avec la longueur des allèles, expliquent plus précisément les différences dans l'activité de cette enzyme et, par conséquent, dans la capacité à libérer les thiols parmi les souches de S. cerevisiae. Bien que l'impact des variantes génétiques des gènes de transport des précurseurs thioliques, comme OPT1 ou GAP1, sur la production de thiols n'ait pas été étudié en profondeur, diverses familles de transporteurs d'oligopeptides ont été identifiées dans différentes souches de S. cerevisiae. Ces familles montrent des préférences spécifiques pour les peptides de différentes tailles (tels que les précurseurs thioliques) et pourraient représenter un avantage adaptatif dans des environnements à faible disponibilité en azote, comme le moût de raisin. En outre, il existe des différences dans la préférence des différentes espèces pour les différents types de précurseurs thioliques présents dans le moût de raisin, ce qui détermine leur contribution directe au profil aromatique thiolique des vins. Les études futures devraient déterminer les déterminants génétiques (variants alléliques, variation du nombre de copies de gènes, etc.) qui justifient la capacité des différentes espèces à transporter les précurseurs thioliques, ainsi que leur réponse aux mécanismes de régulation transcriptionnelle, clés dans ce processus, tels que la répression du catabolisme de l'azote (NCR).

Certains transporteurs situés dans la membrane plasmique jouent un rôle essentiel dans la capture des précurseurs thioliques du milieu extracellulaire (moût de raisin) dans les cellules de levure. L'expression des principaux gènes impliqués (OPT1 - dans une moindre mesure, OPT2- et GAP1) est régulée par la disponibilité de nutriments azotés dans le milieu par des mécanismes de NCR. Ce mécanisme de régulation dépend de facteurs de transcription tels que Gat1p et Gln3p, qui induisent l'expression de gènes liés au métabolisme de sources d'azote non préférentielles. Ces facteurs de transcription sont régulés par la protéine Ure2p, active dans des conditions de disponibilité de sources d'azote préférentielles (c'est-à-dire l'ammonium et certains acides aminés comme la glutamine) et dont la présence bloque l'action de Gat1p et Gln3p, inhibant la transcription des gènes codant pour des transporteurs et des enzymes impliqués dans le catabolisme de sources d'azote moins préférentielles, comme les acides aminés et les oligopeptides conjugués à des arômes thioliques. Lorsque la disponibilité des sources d'azote préférentielles diminue, Gln3p et Gat1p sont libérés et transloquent vers le noyau, activant l'expression des gènes pour le métabolisme des sources d'azote alternatives. De plus, IRC7, le principal gène responsable de la production des enzymes de l'activité β-lyase sur les précurseurs de la 4-MSP, est régulé par NCR, et son expression est inhibée dans des conditions de forte disponibilité des sources d'azote préférentielles dans le moût. De plus, dans ce cas, la disponibilité du soufre et du cuivre dans le milieu joue également un rôle crucial dans la régulation de l'expression des enzymes de l'activité β-lyase, comme CYS3, dont l'expression augmente dans des conditions de carence en soufre, ou IRC7, dont l'expression diminue à des concentrations élevées en cuivre. Il convient de noter que les niveaux d'expression des gènes, en plus de répondre aux facteurs environnementaux, varient entre les souches de levure, ce qui, avec l'existence de variants alléliques, peut expliquer la capacité variable des différentes souches ou espèces à libérer des thiols pendant la fermentation. En outre, les différentes souches de levure présentent une sensibilité variable aux mécanismes NCR, un aspect clé pour expliquer les différents niveaux de libération de thiols volatils entre les souches.

Au cours des deux dernières décennies, les mécanismes moléculaires déterminant la libération de composés thioliques dans les fermentations vinicoles ont été décrits, et des aspects clés ont été définis pour la bioprospection de souches de S. cerevisiae présentant des caractéristiques œnologiques optimales, en exploitant la diversité naturelle de l'espèce. Grâce aux connaissances décrites ci-dessus, il existe actuellement des souches de levure ayant une grande capacité à libérer des thiols variétaux dans les vins, et certaines stratégies œnologiques nécessaires pour maximiser cette capacité sont connues (par exemple, l'optimisation de la nutrition azotée). Malgré cela, la biotechnologie microbienne a introduit des outils alternatifs qui peuvent contribuer à améliorer l'efficacité de ce processus. Il s'agit notamment de l'utilisation du génie génétique, des consortiums microbiens ou de la biologie synthétique en tant qu'outils clés pour améliorer la production de composés aromatiques thioliques.

L'utilisation des techniques de génie génétique est régie par des réglementations spécifiques qui limitent leur application industrielle, bien qu'au niveau expérimental, des dizaines de mutants aient été développés pour mieux comprendre les déterminants génétiques de la libération des thiols. Les premiers travaux utilisant le génie génétique pour augmenter la libération des thiols dans les vins ont introduit le gène tnaA de la bactérie Escherichia coli, codant pour une tryptophanase avec une activité cystathionine β-lyase, dans S. cerevisiae de deux manières différentes : en l'intégrant dans le génome de la levure et sous la forme d'un plasmide multicopies (extrachromosomique). Les résultats ont montré que l'intégration du génome augmentait la production de thiols volatils 4MSP et 3SH à des concentrations jusqu'à 25 fois supérieures à celles des souches non modifiées et supérieures à celles obtenues avec des plasmides multicopies, soulignant l'importance de la stabilité et de l'expression du gène dans l'activité enzymatique pour la libération des thiols.

Dans des travaux ultérieurs, une approche similaire a été utilisée pour insérer tnaA, mais cette fois accompagné de gènes de S. cerevisiae impliqués dans le métabolisme du glutathion, comme GSH1 (glutathion synthase) et GTT1 (glutathion S-transférase), afin d'augmenter le métabolisme du glutathion de la levure. Ainsi, la combinaison de ces deux gènes avec le gène tnaA a multiplié la production de 3SH par 10 par rapport à la souche portant uniquement le gène tnaA. En outre, au cours du 21e siècle, des techniques de clonage extrêmement polyvalentes et efficaces ont été mises au point. Des outils d'édition génétique tels que CRISPR-Cas9 (et similaires) ont également été utilisés pour l'édition génétique de S. cerevisiae. Par exemple, des mutants ont été générés pour augmenter la production de 3SH en introduisant le gène tnaA. Dans ce cas, l'introduction du gène tnaA augmente naturellement l'activité dans la levure des gènes natifs codant pour les acétyltransférases ATF1 et ATF2, enzymes qui transforment le 3SH en son dérivé acétylé, le 3-SHA. Ces souches ont atteint des concentrations finales allant jusqu'à 7 000 ng/L de 3-SHA dans le Sauvignon Blanc (100 fois plus que dans la fermentation témoin), intensifiant ainsi le profil aromatique du vin.

Cependant, d'autres techniques, telles que la mutagenèse aléatoire combinée à des approches génétiques classiques, ont permis le développement de souches aux caractéristiques optimisées, compatibles avec leurs applications industrielles et conformes aux réglementations en vigueur et aux exigences de l'industrie. En relation avec ces approches, des études utilisant la sélection moléculaire, une méthode combinant la reproduction sexuée et la recombinaison entre des souches commerciales de S. cerevisiae et des souches portant des mutations spécifiques (comme dans le gène URE2), ont obtenu des résultats prometteurs dans l'augmentation de la production de thiols. En croisant des souches présentant des mutations bénéfiques dans le gène URE2 mais une faible aptitude œnologique avec des souches commerciales, puis en rétrocroisant leur progéniture avec le parent commercial pendant quatre générations, on a généré des souches de S. cerevisiae qui conservaient les caractéristiques technologiques optimales de la souche commerciale tout en portant la mutation du gène URE2 de la souche non commerciale. Cela a permis d'augmenter la concentration en thiols volatils de 2 à 7 fois par rapport à la fermentation de contrôle.

D'autre part, l'utilisation de souches sélectionnées de différentes espèces non-Saccharomyces a également donné des résultats pertinents en matière de production de thiols dans les fermentations vinicoles. Des espèces comme Metschnikowia pulcherrima et Torulaspora delbrueckii se distinguent par leur capacité à libérer du 3SH et son dérivé acétylé, en fonction de la souche et des conditions de fermentation. Diverses études ont démontré que leur utilisation dans des fermentations séquentielles avec S. cerevisiae augmente la libération de thiols. Le rôle positif de Lachancea thermotolerans dans la libération des thiols a également été décrit récemment, en raison d'une plus grande capacité à consommer et à transformer les précurseurs thioliques, en particulier le 3-SH à partir de son précurseur glutathionylé.

Dans cette ligne, la conception de consortiums microbiens complexes (avec plusieurs espèces) qui exploitent différentes caractéristiques de S. cerevisiae et d'espèces non-Saccharomyces pour optimiser la libération de composés aromatiques tout en maintenant une cinétique de fermentation adéquate est digne d'intérêt. La combinaison de cinq espèces différentes : M. pulcherrima et T. delbrueckii pour augmenter la libération de thiols, Hanseniaspora uvarum et Candida zemplinina pour retarder la croissance de S. cerevisiae et ainsi favoriser l'action des deux premières, et S. cerevisiae, pour compléter adéquatement le processus de fermentation. Ces approches ne sont pas sans complications dans leur pratique industrielle, à la fois en raison de la complexité de la production d'inocula industriels d'espèces multiples et du contrôle ultérieur du comportement complexe de l'inocula. Dans ce sens, il a été démontré que le comportement des consortiums complexes (contenant 2 à 6 espèces), en plus de présenter des propriétés émergentes qui peuvent conduire à de nouvelles fonctions métaboliques d'intérêt industriel, est prévisible sur la base de l'écologie des différentes espèces faisant partie du consortium, ce qui rend l'utilisation des consortiums microbiens en œnologie prometteuse.

Enfin, à l'avenir, la biologie synthétique offre une approche prometteuse, et l'on peut s'attendre à ce que cette discipline permette, dans le cadre de l'industrie œnologique, de redessiner les souches de levure actuelles ou de créer des systèmes biologiques entièrement nouveaux afin d'optimiser la qualité sensorielle du vin. Ces systèmes devraient combiner les caractéristiques inhérentes à S. cerevisiae, telles que sa capacité fermentaire élevée, avec celles d'autres espèces non-Saccharomyces qui, grâce à leur métabolisme et à leur vaste répertoire enzymatique, augmentent la complexité sensorielle du vin. Cela permettra de créer des souches chimériques, plus polyvalentes dans la production d'arômes, mais conservant un profil fermentaire robuste face aux défis actuels de l'industrie, défis qui découlent principalement de l'évolution des conditions climatiques (vins avec des niveaux d'alcool potentiels élevés, déficients en nutriments et présentant des déséquilibres d'acidité) et des demandes des consommateurs.