Fortschritte in der Hefegenetik verbessern das aromatische Profil von Weißweinen

Polyfunktionelle Mercaptane, wie z. B. die Thiole der Rebsorten, sind für das Aromaprofil von Weißweinen von entscheidender Bedeutung. Diese Verbindungen, die mit tropischen und krautigen Aromen in Verbindung gebracht werden, liegen in den Trauben als nichtflüchtige Vorstufen vor. Die Hefeenzyme setzen während der Gärung den flüchtigen Anteil frei, wodurch die entsprechenden Aromen entstehen. Faktoren wie Rebsorte, Weinbaupraktiken und Umweltbedingungen wirken sich direkt auf die Verfügbarkeit dieser Vorstufen und ihre Umwandlung in flüchtige Aromen während der Weinbereitung aus. Der Hefestoffwechsel, insbesondere die Fähigkeit der Hefe, diese Vorstufen zu internalisieren und zu verarbeiten, ist der Schlüssel zur Bestimmung des endgültigen Thiolgehalts im Wein. Genetische Variationen zwischen Hefen und Unterschiede in der Weinbereitung können die Freisetzung dieser aromatischen Verbindungen fördern oder einschränken. Biotechnologische Strategien, wie die Auswahl von Stämmen mit spezifischen genetischen Merkmalen oder deren Veränderung durch genetische Verbesserungstechniken, haben sich als wirksam erwiesen, um die Thiolkonzentration in Weinen zu erhöhen. Darüber hinaus bieten mikrobielle Konsortien und neue Technologien wie die synthetische Biologie vielversprechende Aussichten für die Verbesserung der Thiolproduktion bei gleichzeitiger Wahrung eines optimalen Gleichgewichts zwischen Fermentationskapazität und Aromabildung. Angesichts der Herausforderungen, denen sich die Branche gegenübersieht, wie Klimawandel und veränderte Verbraucherpräferenzen, verspricht die Entwicklung dieser innovativen Lösungen eine deutliche Verbesserung der sensorischen Qualität von Weinen.

Polyfunktionelle Mercaptane sind schwefelhaltige aromatische Verbindungen, die eine Schlüsselrolle bei der sensorischen Differenzierung von Weinen spielen, vor allem von Weißweinen, insbesondere von Weinen aus Sorten wie Sauvignon Blanc, Semillon oder Verdejo. Die Thiole der Rebsorten tragen wesentlich zur aromatischen Qualität der Weine bei und verleihen ihnen charakteristische Aromen von tropischen Früchten und Kräutern, was sie zu einem der meist untersuchten Aspekte der Weinchemie in den letzten Jahrzehnten gemacht hat. Trotz der Fortschritte beim Verständnis der genetischen und metabolischen Grundlagen der Synthese von Thiolvorläufern in Reben und ihrer Freisetzung durch Hefen bleiben viele Fragen unbeantwortet. Die Identifizierung der Gene, die für die Produktion von Thiolvorläufern in Reben verantwortlich sind, und die Frage, wie ihre Expression als Reaktion auf verschiedene Umweltreize reguliert wird, sind Bereiche, die weiterer Forschung bedürfen. Darüber hinaus könnte die Aufklärung der genetischen Variationen zwischen verschiedenen Rebsorten neue Instrumente für die Auswahl von Sorten mit größerem Potenzial für die Erzeugung aromatischer, thiolhaltiger Weine bieten.

Die wichtigsten Verbindungen, die die thiolische Fraktion der Weine bilden, sind 4MSP (4-Methyl-4-sulfanyl-pentan-2-on), 3MH (3-Mercaptohexan-1-ol) und sein acetyliertes Derivat 3MHA (3-Mercaptohexylacetat), die aufgrund ihrer niedrigen Wahrnehmungsschwelle einen erheblichen sensorischen Einfluss auf das Aromaprofil des Weins haben. Diese Thiole kommen in den Trauben nicht in ihrer flüchtigen Form vor, sondern als mit Aminosäuren oder Oligopeptiden (vor allem Cystein und Glutathion) konjugierte Vorstufen, die während der Gärung durch Hefeenzyme freigesetzt werden müssen, um die für das Aroma verantwortlichen flüchtigen Verbindungen freizusetzen. Die Freisetzung von Thiolen hängt jedoch nicht nur von der enzymatischen Kapazität der Hefe ab, sondern auch von der Menge und Verfügbarkeit der Vorstufen im Traubenmost. Die Verfügbarkeit dieser Vorstufen hängt von der Rebsorte, den Weinbaupraktiken und den Umweltbedingungen sowie von biotischen Faktoren wie der Botrytis cinerea-Infektion ab. Diese Stimuli können die Expression bestimmter Gene induzieren, die die Akkumulation von Thiolvorläufern in den Beeren erhöhen, was sich direkt auf die Fähigkeit der Hefe auswirkt, während der Gärung Thiole freizusetzen.

Der Prozess der Thiol-Freisetzung während der Gärung hängt von Hefen ab, die in der Lage sind, ihre Vorstufen zu internalisieren und β-Lyase-Enzyme zu exprimieren, die Cystein- und Glutathion-Konjugate spalten und die flüchtigen Thiole freisetzen, die für das Weinaroma verantwortlich sind. Neben S. cerevisiae können auch andere Hefearten Thiole freisetzen und haben sich als nützliche Werkzeuge zur Erhöhung der Konzentration dieser Verbindungen im Wein erwiesen, entweder durch genetische Varianten der beteiligten Gene oder durch eine andere Transkriptionsregulierung als S. cerevisiae oder durch die Auslösung interspezifischer Interaktionsprozesse, die zu synergistischen Effekten zwischen den aktiven Hefen während der Gärung führen. Es wurde jedoch festgestellt, dass Hefen zwar Thiole freisetzen können, aber nur ein kleiner Teil der im Most vorhandenen Vorstufen tatsächlich in flüchtige Verbindungen umgewandelt wird. Dies ist zum Teil auf die komplexe Regulierung der Genexpression zurückzuführen, die an der Internalisierung von Thiolen und der anschließenden Freisetzung in Hefen beteiligt ist, was die Notwendigkeit unterstreicht, die molekularen Grundlagen der Thiol-Freisetzung bei der Weinherstellung weiter zu verstehen, um mikrobiologische Hilfsmittel oder önologische Verfahren zu entwickeln, die ihre Freisetzung maximieren.

Der endgültige Thiolgehalt im Wein hängt zunächst vom Vorhandensein und der Konzentration ihrer Vorstufen im Most ab, aber auch der Hefestoffwechsel während der Gärung ist ein wichtiger Aspekt bei der Freisetzung von Thiolaromen. Hefen, sowohl S. cerevisiae als auch andere Nicht-Saccharomyces-Arten, internalisieren thiolische Vorstufen und hydrolysieren sie enzymatisch, wobei sie das gewonnene Ammonium und Pyruvat für ihren Stoffwechsel verwenden und die flüchtige Fraktion der Vorstufe als freie Thiole freisetzen. In S. cerevisiae sind die an diesem Prozess beteiligten Gene bekannt. Die Thiol-Vorstufen werden durch allgemeine Aminosäure- und Oligopeptid-Transporter internalisiert. OPT1 wird als der Haupttransporter für glutathionylierte Vorstufen beschrieben, während der allgemeine Aminosäuretransporter GAP1 für den Großteil der Internalisierung cysteinylierter Vorstufen verantwortlich ist. Einmal im Zytoplasma angekommen, brechen Enzyme mit β-Lyase-Aktivität die C-S-Bindung der cysteinylierten Vorstufen. Die Gene BNA3, CYS3, GLO1 und hauptsächlich IRC7 kodieren die Enzyme, die für die Freisetzung von 4MSP aus Cys-4MSP verantwortlich sind. Andererseits wurde das STR3-Gen als verantwortlich für die Freisetzung von 3SH aus Cys-3SH identifiziert, obwohl seine Spezifität für dieses Substrat gering ist. Die glutathionylierten Vorstufen verwandeln sich nach ihrer Internalisierung über einen komplexen vakuolären Weg, an dem vakuoläre Transporter und Enzyme beteiligt sind, die von Genen wie DUG1, DUG2, DUG3, ECM38 und anderen kodiert werden, in cysteinylierte Vorstufen und folgen dann Hydrolysepfaden, die von Enzymen mit β-Lyase-Aktivität katalysiert werden. Die Bildung des Thiols 3SHA, des acetylierten Derivats von 3SH, aus 3SH wird durch das vom ATF1-Gen kodierte Enzym katalysiert.

Das Wissen um die genetischen Determinanten der Thiolproduktion in Hefen hat zur Erforschung genetischer Varianten in den an diesem Stoffwechsel beteiligten Genen geführt, insbesondere in IRC7. Es wurden zwei allelische Varianten dieses Gens in S. cerevisiae beschrieben: eine vollständige Variante (IRC7F) und eine weitere mit einer 38 bp-Deletion (IRC7S). Diese Deletion verändert das offene Leseraster und erzeugt ein frühes Stoppcodon, das ein kürzeres Enzym mit geringerer katalytischer Aktivität erzeugt. Studien bestätigten, dass S. cerevisiae-Stämme, die homozygot für das IRC7S-Allel sind, eine reduzierte β-Lyase-Aktivität aufweisen, was zu einer geringen oder gar keiner 4MSP-Thiol-Produktion führt. Außerdem zeigten beide Studien, dass die meisten Weinstämme von S. cerevisiae homozygot für das deletierte IRC7S-Allel sind. Diese etwas kontraintuitive Situation, in der die weniger funktionelle Allelvariante von IRC7 in Weinstämmen weit verbreitet ist, wurde durch die Assoziation des IRC7S-Allels mit phänotypischen und genomischen Besonderheiten erklärt, die seine Prävalenz in domestizierten Lebensräumen, insbesondere in Wein, begünstigen.

Außerdem erklärt die zuvor beschriebene Deletion im IRC7-Gen die Unterschiede in der Enzymaktivität von Irc7p nicht vollständig. Es wurden mehrere Einzelnukleotid-Polymorphismen in der IRC7-Sequenz identifiziert, die zusammen mit der Allellänge die Unterschiede in der Aktivität dieses Enzyms und damit in der Fähigkeit zur Freisetzung von Thiolen zwischen S. cerevisiae-Stämmen genauer erklären. Obwohl die Auswirkungen genetischer Varianten in Thiolvorläufer-Transportergenen wie OPT1 oder GAP1 auf die Thiolproduktion noch nicht eingehend untersucht wurden, sind in verschiedenen S. cerevisiae-Stämmen verschiedene Oligopeptid-Transporterfamilien identifiziert worden. Diese Familien zeigen spezifische Präferenzen für Peptide unterschiedlicher Größe (wie Thiolvorstufen) und könnten einen adaptiven Vorteil in Umgebungen mit geringer Stickstoffverfügbarkeit, wie z. B. Traubenmost, darstellen. Darüber hinaus gibt es Unterschiede in der Vorliebe der verschiedenen Arten für verschiedene Arten von Thiolvorläufern im Traubenmost, was ihren direkten Beitrag zum Thiolaromaprofil im Wein bestimmt. Zukünftige Studien sollten die genetischen Determinanten (allelische Varianten, Variation der Genkopienzahl usw.) bestimmen, die die Fähigkeit der verschiedenen Spezies zum Transport von Thiolvorstufen begründen, sowie ihre Reaktion auf transkriptionelle Regulierungsmechanismen, die in diesem Prozess eine Schlüsselrolle spielen, wie z. B. die Stickstoff-Kataboliten-Repression (NCR).

Bestimmte Transporter, die sich in der Plasmamembran befinden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufnahme von Thiolvorläufern aus dem extrazellulären Medium (Traubenmost) in die Hefezellen. Die Expression der wichtigsten beteiligten Gene (OPT1 - in geringerem Maße auch OPT2- und GAP1) wird durch die Verfügbarkeit von stickstoffhaltigen Nährstoffen im Medium über NCR-Mechanismen reguliert. Dieser Regulierungsmechanismus hängt von Transkriptionsfaktoren wie Gat1p und Gln3p ab, die die Expression von Genen induzieren, die mit dem Metabolismus nicht-präferentieller Stickstoffquellen zusammenhängen. Diese Transkriptionsfaktoren werden durch das Ure2p-Protein reguliert, das bei Verfügbarkeit präferentieller Stickstoffquellen (d. h. Ammonium und einige Aminosäuren wie Glutamin) aktiv ist und dessen Anwesenheit die Wirkung von Gat1p und Gln3p blockiert, indem es die Transkription von Genen hemmt, die für Transporter und Enzyme kodieren, die am Abbau weniger präferentieller Stickstoffquellen beteiligt sind, wie Aminosäuren und Oligopeptide, die mit thiolischen Aromen konjugiert sind. Wenn die Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquellen abnimmt, werden Gln3p und Gat1p freigesetzt und in den Zellkern verlagert, wodurch die Expression von Genen für den Stoffwechsel alternativer Stickstoffquellen aktiviert wird. Darüber hinaus wird IRC7, das Hauptgen, das für die Produktion von Enzymen mit β-Lyase-Aktivität auf 4-MSP-Vorstufen verantwortlich ist, durch NCR reguliert, und seine Expression wird unter Bedingungen einer hohen Verfügbarkeit von bevorzugten Stickstoffquellen im Most gehemmt. Darüber hinaus spielt in diesem Fall auch die Verfügbarkeit von Schwefel und Kupfer im Medium eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Expression von Enzymen mit β-Lyase-Aktivität, wie CYS3, dessen Expression unter schwefelarmen Bedingungen ansteigt, oder IRC7, dessen Expression bei hohen Kupferkonzentrationen abnimmt. Es ist bemerkenswert, dass die Genexpressionsniveaus nicht nur auf Umweltfaktoren reagieren, sondern auch zwischen den Hefestämmen variieren, was zusammen mit dem Vorhandensein von Allelvarianten die unterschiedliche Fähigkeit der verschiedenen Stämme oder Arten, Thiole während der Gärung freizusetzen, erklären kann. Darüber hinaus weisen verschiedene Hefestämme eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber NCR-Mechanismen auf, ein Schlüsselaspekt zur Erklärung der unterschiedlichen Freisetzung flüchtiger Thiole bei den verschiedenen Stämmen.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden die molekularen Mechanismen beschrieben, die für die Freisetzung von Thiolverbindungen bei der Weingärung ausschlaggebend sind, und es wurden Schlüsselaspekte für die Bioprospektion von S. cerevisiae-Stämmen mit optimalen önologischen Eigenschaften definiert, wobei die natürliche Vielfalt der Art genutzt wurde. Dank der oben beschriebenen Erkenntnisse gibt es heute Hefestämme mit einer hohen Kapazität zur Freisetzung von Sorten-Thiolen in Weinen, und bestimmte önologische Strategien, die zur Maximierung dieser Fähigkeit erforderlich sind, sind bekannt (z. B. die Optimierung der Stickstoffversorgung). Dennoch hat die mikrobielle Biotechnologie alternative Werkzeuge eingeführt, die zur Verbesserung der Effizienz dieses Prozesses beitragen können. Dazu gehören die Gentechnik, mikrobielle Konsortien oder die synthetische Biologie als Schlüsselinstrumente zur Verbesserung der Produktion von thiolischen aromatischen Verbindungen.

Der Einsatz gentechnischer Verfahren wird durch spezifische Vorschriften geregelt, die ihre industrielle Anwendung einschränken, obwohl auf experimenteller Ebene Dutzende von Mutanten entwickelt wurden, um die genetischen Determinanten der Thiol-Freisetzung besser zu verstehen. Bei der ersten Arbeit, bei der die Gentechnik zur Erhöhung der Thiol-Freisetzung in Weinen eingesetzt wurde, wurde das tnaA-Gen aus dem Bakterium Escherichia coli, das für eine Tryptophanase mit Cystathionin-β-Lyase-Aktivität kodiert, auf zwei verschiedene Arten in S. cerevisiae eingeführt: durch Integration in das Hefegenom und als Multikopie-Plasmid (extrachromosomal). Die Ergebnisse zeigten, dass die Genomintegration die Produktion der flüchtigen Thiole 4MSP und 3SH in Konzentrationen steigerte, die bis zu 25-mal höher waren als bei unmodifizierten Stämmen und höher als bei Multikopie-Plasmiden, was die Bedeutung der Genstabilität und -expression für die enzymatische Aktivität der Thiol-Freisetzung unterstreicht.

In nachfolgenden Arbeiten wurde ein ähnlicher Ansatz verwendet, um tnaA einzufügen, aber dieses Mal zusammen mit S. cerevisiae-Genen, die am Glutathion-Stoffwechsel beteiligt sind, wie GSH1 (Glutathion-Synthase) und GTT1 (Glutathion-S-Transferase), um den Glutathion-Stoffwechsel der Hefe zu erhöhen. Durch die Kombination beider Gene mit tnaA wurde die 3SH-Produktion im Vergleich zu dem Stamm, der nur das tnaA-Gen trägt, verzehnfacht. Darüber hinaus wurden im 21. Jahrhundert äußerst vielseitige und effektive Klonierungstechniken entwickelt. Gen-Editing-Tools wie CRISPR-Cas9 (und ähnliche) wurden auch für das genetische Editing von S. cerevisiae eingesetzt. So wurden beispielsweise Mutanten zur Steigerung der 3SH-Produktion durch Einführung des tnaA-Gens erzeugt. In diesem Fall erhöht die Einführung des tnaA-Gens auf natürliche Weise die Hefeaktivität nativer Gene, die für die Acetyltransferasen ATF1 und ATF2 kodieren, Enzyme, die 3SH in sein acetyliertes Derivat 3-SHA umwandeln. Diese Stämme erreichten in Sauvignon Blanc Endkonzentrationen von bis zu 7.000 ng/L 3-SHA (100-mal mehr als bei der Kontrollfermentation) und intensivierten das Aromaprofil des Weins.

Andere Techniken, wie die Zufallsmutagenese in Verbindung mit klassischen genetischen Ansätzen, haben jedoch die Entwicklung von Stämmen mit optimierten Eigenschaften ermöglicht, die mit ihren industriellen Anwendungen kompatibel sind und den aktuellen Vorschriften und Anforderungen der Industrie entsprechen. Im Zusammenhang mit diesen Ansätzen haben Studien unter Verwendung der molekularen Züchtung, einer Methode, die sexuelle Fortpflanzung und Rekombination zwischen kommerziellen S. cerevisiae-Stämmen und Stämmen, die spezifische Mutationen (wie im URE2-Gen) tragen, kombiniert, vielversprechende Ergebnisse bei der Steigerung der Thiolproduktion erzielt. Durch Kreuzung von Stämmen mit vorteilhaften Mutationen in URE2, aber geringer önologischer Fitness mit kommerziellen Stämmen und anschließender Rückkreuzung ihrer Nachkommen mit dem kommerziellen Elternteil über vier Generationen wurden S. cerevisiae-Stämme erzeugt, die die optimalen technologischen Eigenschaften des kommerziellen Stammes beibehielten und gleichzeitig die Mutation des URE2-Gens des nicht kommerziellen Stammes trugen. Dadurch stieg die Konzentration flüchtiger Thiole im Vergleich zur Kontrollfermentation um das 2- bis 7-fache.

Andererseits hat die Verwendung ausgewählter Stämme verschiedener Nicht-Saccharomyces-Arten ebenfalls relevante Ergebnisse bei der Thiolproduktion in der Weingärung gezeigt. Arten wie Metschnikowia pulcherrima und Torulaspora delbrueckii zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, 3SH und dessen acetyliertes Derivat freizusetzen, je nach Stamm und Fermentationsbedingungen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass ihre Verwendung in sequentiellen Fermentationen mit S. cerevisiae die Thiol-Freisetzung erhöht. Kürzlich wurde auch die positive Rolle von Lachancea thermotolerans bei der Thiol-Freisetzung beschrieben, die auf eine größere Fähigkeit zum Verbrauch und zur Umwandlung von Thiol-Vorläufern, insbesondere von 3-SH aus seinem glutathionylierten Vorläufer, zurückzuführen ist.

In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung komplexer mikrobieller Konsortien (mit mehreren Arten), die verschiedene Eigenschaften von S. cerevisiae und anderen Arten nutzen, um die Freisetzung von Aromastoffen zu optimieren und gleichzeitig eine angemessene Fermentationskinetik aufrechtzuerhalten, bemerkenswert. Die Kombination von fünf verschiedenen Arten: M. pulcherrima und T. delbrueckii, um die Thiol-Freisetzung zu erhöhen, Hanseniaspora uvarum und Candida zemplinina, um das Wachstum von S. cerevisiae zu verzögern und so die Wirkung der beiden erstgenannten Arten zu begünstigen, und S. cerevisiae, um den Fermentationsprozess angemessen abzuschließen. Diese Ansätze sind in der industriellen Praxis nicht ohne Komplikationen, sowohl wegen der Komplexität der Herstellung industrieller Inokula aus mehreren Arten als auch wegen der anschließenden Kontrolle des komplexen Verhaltens der Inokula. In diesem Sinne hat sich gezeigt, dass das Verhalten komplexer Konsortien (mit 2 bis 6 Spezies) nicht nur emergente Eigenschaften aufweist, die zu neuen Stoffwechselfunktionen von industriellem Interesse führen können, sondern auch aufgrund der Ökologie der verschiedenen Spezies, die Teil des Konsortiums sind, vorhersehbar ist, was die Verwendung von mikrobiellen Konsortien in der Önologie vielversprechend macht.

Schließlich bietet die synthetische Biologie in Zukunft einen vielversprechenden Ansatz, und es ist zu erwarten, dass diese Disziplin im Rahmen der önologischen Industrie die Neugestaltung aktueller Hefestämme oder die Schaffung völlig neuer biologischer Systeme zur Optimierung der sensorischen Weinqualität ermöglichen wird. Diese Systeme sollten die inhärenten Eigenschaften von S. cerevisiae, wie z. B. seine hohe Fermentationskapazität, mit denen anderer Nicht-Saccharomyces-Arten kombinieren, die dank ihres Stoffwechsels und ihres umfangreichen enzymatischen Repertoires die sensorische Komplexität von Wein erhöhen. Auf diese Weise werden chimäre Stämme entstehen, die vielseitiger in der Aromaproduktion sind, aber gleichzeitig ein robustes Gärungsprofil aufweisen, das den aktuellen Herausforderungen der Branche gewachsen ist; Herausforderungen, die sich vor allem aus den sich ändernden klimatischen Bedingungen (Weine mit hohem potenziellem Alkoholgehalt, mit Nährstoffmangel und mit unausgewogenem Säuregehalt) und den Anforderungen der Verbraucher ergeben.