酵母遗传学的进步提升了白葡萄酒的芳香特征

多官能硫醇，如品种硫醇，对白葡萄酒的芳香特征至关重要。这些与热带和草本植物香气有关的化合物以非挥发性前体形式存在于葡萄中。在发酵过程中，酵母酶会释放出挥发性部分，从而产生相关的香气。葡萄品种、葡萄栽培方法和环境条件等因素会直接影响这些前体物质的可用性，并在酿酒过程中转化为挥发性香气。酵母的新陈代谢，尤其是其内化和处理这些前体的能力，是决定葡萄酒中硫醇最终含量的关键。酵母菌之间的基因差异和酿酒方法的不同会增强或限制这些芳香化合物的释放。生物技术策略，如选择具有特定遗传特征的菌株或通过遗传改良技术对其进行改良，已被证明能有效提高葡萄酒中的硫醇浓度。此外，利用微生物联合体和合成生物学等新技术，在提高硫醇产量的同时保持发酵能力和香气生成之间的最佳平衡，也具有广阔的前景。随着葡萄酒行业面临气候变化和消费者偏好转变等挑战，开发这些创新解决方案有望显著改善葡萄酒的感官质量。

多官能硫醇是一种含硫芳香化合物，在葡萄酒（主要是白葡萄酒，尤其是长相思、赛美蓉或维尔德霍等品种酿造的葡萄酒）的感官区分中起着关键作用。其中，品种硫醇对葡萄酒的芳香品质有很大贡献，提供了特有的热带水果和草本植物的芳香，使其成为近几十年来葡萄酒化学研究最多的方面之一。尽管人们对葡萄藤中品种硫醇前体合成和酵母释放硫醇的遗传和代谢基础的了解取得了进展，但仍有许多问题没有答案。确定葡萄树中产生硫醇前体的基因以及这些基因在不同环境刺激下的表达调控是需要进一步研究的领域。此外，阐明不同葡萄品种之间的遗传变异，可以为选择更有潜力生产富含硫醇的芳香葡萄酒的栽培品种提供新的工具。

构成葡萄酒中硫醇类成分的主要化合物是 4MSP（4-甲基-4-硫酰基-2-戊酮）、3MH（3-巯基-1-己醇）及其乙酰化衍生物 3MHA（3-巯基己基乙酸酯）。这些硫醇在葡萄中并不以挥发性形式存在，而是以与氨基酸或寡肽（主要是半胱氨酸和谷胱甘肽）共轭的前体形式存在，在发酵过程中需要酵母酶的作用才能释放出香气的挥发性化合物。然而，硫醇的释放不仅与酵母酶的能力有关，还受到葡萄汁中前体物的数量和可用性的影响。这些前体物质的可用性取决于葡萄品种、葡萄栽培方法和环境条件，以及灰葡萄孢菌感染等生物因素。这些刺激会诱导某些基因的表达，增加浆果中硫醇前体的积累，直接影响酵母在发酵过程中释放硫醇的能力。

发酵过程中硫醇的释放过程取决于酵母能否内化硫醇前体，并表达能分解半胱氨酸和谷胱甘肽共轭物的β-裂解酶，从而释放出葡萄酒香气所需的挥发性硫醇。除酿酒酵母外，其他酵母菌也能释放硫醇，并已被证明是提高葡萄酒中这些化合物浓度的有用工具。这些酵母菌或通过相关基因的遗传变异，或通过与酿酒酵母不同的转录调控，或通过引发种间相互作用过程，从而在发酵过程中产生活性酵母之间的协同效应。不过，据观察，虽然酵母菌能释放硫醇，但只有一小部分存在于葡萄汁中的前体物质能有效转化为挥发性化合物。这部分是由于酵母中涉及硫醇内化和随后释放的基因表达调控非常复杂，因此需要继续了解酿酒过程中硫醇释放的分子基础，以开发能最大限度释放硫醇的微生物工具或酿酒工艺路线。

葡萄酒中硫醇的最终含量最初取决于葡萄汁中硫醇前体的存在和浓度，但酵母在发酵过程中的新陈代谢也是释放硫醇香气的一个关键方面。酵母（包括酿酒酵母和其他非酿酒酵母）会内化硫醇前体并对其进行酶水解，利用衍生的铵和丙酮酸进行新陈代谢，并以游离硫醇的形式释放前体的挥发性部分。在 S. cerevisiae 中，参与这一过程的基因是已知的。硫醇前体通过一般氨基酸和寡肽转运体内化。OPT1 是谷胱甘肽化前体的主要转运体，而一般氨基酸转运体 GAP1 则负责大部分半胱氨酰化前体的内化。一旦进入细胞质，β-裂解酶活性酶就会切断半胱氨酰化前体的 C-S 键。基因 BNA3、CYS3、GLO1，主要是 IRC7 编码负责从 Cys-4MSP 中释放 4MSP 的酶。另一方面，已确定 STR3 基因负责从 Cys-3SH 中释放 3SH，尽管它对这种底物的特异性很低。至于谷胱甘肽化的前体，一旦内化，它们就会通过复杂的液泡途径转化为半胱氨酰化的前体，其中涉及液泡转运体和由 DUG1、DUG2、DUG3、ECM38 等基因编码的酶，然后在 β-裂解酶活性酶的催化下进入水解途径。至于硫醇 3SHA，即 3SH 的乙酰化衍生物，它是由 ATF1 基因编码的酶催化从 3SH 生成的。

对酵母中硫醇产生的遗传决定因素的了解推动了对参与这种新陈代谢的基因，特别是 IRC7 基因的遗传变异的探索。目前已描述了该基因在 S. cerevisiae 中的两个等位基因变体：一个是完全变体（IRC7F），另一个是缺失了 38 bp 的变体（IRC7S）。这种缺失改变了开放阅读框，产生了一个早期终止密码子，从而产生了一种催化活性较低的短酶。研究证实，等位基因 IRC7S 的 S. cerevisiae 菌株的 β-裂解酶活性降低，导致 4MSP 硫醇产量低或不产生。此外，这两项研究还表明，大多数酿酒葡萄孢菌株都是等位基因 IRC7S 缺失的同源株。IRC7S 等位基因与表型和基因组的特殊性有关，这有利于其在驯化栖息地，尤其是在葡萄酒中的流行。

此外，之前描述的 IRC7 基因缺失并不能完全解释 Irc7p 酶活性的差异。目前已发现 IRC7 序列中的几个单核苷酸多态性，它们与等位基因长度一起，能更准确地解释该酶活性的差异，从而解释 S. cerevisiae 菌株之间释放硫醇能力的差异。虽然尚未深入研究硫醇前体转运体基因（如 OPT1 或 GAP1）的遗传变异对硫醇产生的影响，但已在不同的 S. cerevisiae 菌株中发现了各种寡肽转运体家族。这些家族对不同大小的肽（如硫醇前体）表现出特定的偏好，可能代表了在低氮可用性环境（如葡萄汁）中的适应优势。此外，不同物种对葡萄汁中不同类型硫醇前体的偏好存在差异，这决定了它们对葡萄酒中硫醇香气的直接贡献。未来的研究应确定遗传决定因素（等位基因变异、基因拷贝数变异等），以证明不同物种转运硫醇前体的能力，以及它们对转录调控机制的反应，转录调控机制是这一过程的关键，如氮代谢抑制（NCR）。

位于质膜上的某些转运体在将硫醇前体从细胞外介质（葡萄汁）捕获到酵母细胞中起着至关重要的作用。主要相关基因（OPT1（其次是 OPT2-和 GAP1））的表达受培养基中氮营养物质的可用性通过 NCR 机制调节。这种调节机制取决于 Gat1p 和 Gln3p 等转录因子，它们会诱导与非优先氮源代谢相关的基因表达。这些转录因子受 Ure2p 蛋白的调控，Ure2p 蛋白在优先氮源（即铵和某些氨基酸，如谷氨酰胺）可用的条件下非常活跃，它的存在会阻断 Gat1p 和 Gln3p 的作用，抑制编码转运体和酶的基因的转录，这些基因参与较少优先氮源（如氨基酸和与硫醇香气共轭的寡肽）的分解代谢。当优先氮源减少时，Gln3p 和 Gat1p 被释放并转运到细胞核，激活替代氮源代谢基因的表达。此外，负责在 4-MSP 前体上产生 β-lyase 活性酶的主要基因 IRC7 也受 NCR 调节，在必须氮源供应量高的条件下，其表达受到抑制。此外，在这种情况下，培养基中硫和铜的可用性也对 β-裂解酶活性酶的表达起着至关重要的调节作用，如 CYS3，其表达量在缺硫条件下会激增；或 IRC7，其表达量在铜浓度高时会降低。值得注意的是，基因表达水平除了对环境因素做出反应外，还因酵母菌株而异，再加上等位基因变体的存在，可以解释不同菌株或菌种在发酵过程中释放硫醇的能力各不相同。此外，不同的酵母菌株对 NCR 机制表现出不同的敏感性，这是解释不同菌株挥发性硫醇释放水平的一个关键方面。

在过去的二十年里，决定葡萄酒发酵过程中硫醇化合物释放的分子机制已被描述，并确定了利用物种的天然多样性，对具有最佳酿酒特性的酿酒酵母菌株进行生物勘探的关键方面。根据上述知识，目前有一些酵母菌株在葡萄酒中具有很高的释放品种硫醇的能力，而最大限度地释放硫醇所需的某些酿酒策略（如优化氮营养）也已为人所知。尽管如此，微生物生物技术已经引入了其他有助于提高这一过程效率的工具。这些工具包括利用基因工程、微生物联合体或合成生物学作为提高硫醇芳香化合物生产的关键工具。

基因工程技术的使用受到特定法规的监管，限制了其工业应用，不过在实验层面，已经开发出数十种突变体，以更好地了解硫醇释放的基因决定因素。第一项利用基因工程增加葡萄酒中硫醇释放量的工作是将大肠杆菌中的 tnaA 基因（该基因编码一种具有胱硫醚 β-裂解酶活性的色氨酸酶）以两种不同的方式引入到 S. cerevisiae 中：将其整合到酵母基因组中和作为多拷贝质粒（染色体外）。结果表明，基因组整合提高了挥发性硫醇 4MSP 和 3SH 的产量，其浓度比未修饰菌株高出 25 倍，比多拷贝质粒获得的浓度更高，这突出了基因稳定性和酶活性表达对硫醇释放的重要性。

在随后的工作中，采用了类似的方法插入 tnaA，但这次同时插入了参与谷胱甘肽代谢的 S. cerevisiae 基因，如 GSH1（谷胱甘肽合成酶）和 GTT1（谷胱甘肽 S-转移酶），以提高酵母的谷胱甘肽代谢。因此，与只携带 tnaA 基因的菌株相比，将这两个基因与 tnaA 结合可使 3SH 产量增加 10 倍。此外，在 21 世纪，人们还开发出了极为通用和有效的克隆技术。基因编辑工具，如 CRISPR-Cas9（和类似工具）也被用于 S. cerevisiae 的基因编辑。例如，通过引入 tnaA 基因，产生了增加 3SH 产量的突变体。在这种情况下，引入 tnaA 基因会自然增加编码乙酰转移酶 ATF1 和 ATF2（将 3SH 转化为乙酰化衍生物 3-SHA 的酶）的原生基因的酵母活性。这些菌株在长相思中的 3-SHA 最终浓度高达 7,000 纳克/升（是对照发酵浓度的 100 倍），增强了葡萄酒的芳香特征。

然而，其他技术，如随机诱变与经典遗传学相结合的方法，也能开发出具有优化特性的菌株，这些特性符合其工业应用，并符合现行法规和行业要求。分子育种是一种将有性生殖与商业酿酒葡萄孢菌株和携带特定突变（如URE2 基因）的菌株之间的重组相结合的方法，与这些方法有关的研究在提高硫醇产量方面取得了可喜的成果。通过将URE2基因发生有益突变但酿酒适应性较低的菌株与商业菌株杂交，然后将其后代与商业亲本回交四代，产生了既能保持商业菌株的最佳技术特性，又能携带非商业菌株URE2基因突变的酿酒葡萄孢菌株。与对照发酵相比，挥发性硫醇浓度增加了 2 至 7 倍。

另一方面，在葡萄酒发酵过程中，使用不同非酵母菌种的精选菌株生产硫醇也取得了相关结果。Metschnikowia pulcherrima 和 Torulaspora delbrueckii 等菌种因其释放 3SH 及其乙酰化衍生物的能力而脱颖而出，这取决于菌种和发酵条件。多项研究表明，在与 S. cerevisiae 的连续发酵中使用它们可以增加硫醇的释放。最近还描述了 Lachancea thermotolerans 在硫醇释放中的积极作用，这是因为它们消耗和转化硫醇前体的能力更强，尤其是谷胱甘肽化前体 3-SH。

在这方面，值得注意的是设计复杂的微生物联合体（包含多个物种），利用酿酒酵母和非酿酒酵母物种的不同特性来优化芳香化合物的释放，同时保持适当的发酵动力学。结合了五个不同的物种：M. pulcherrima 和 T. delbrueckii 增加硫醇的释放，Hanseniaspora uvarum 和 Candida zemplinina 延缓酿酒酵母的生长，从而有利于前两者的作用，而酿酒酵母则充分完成发酵过程。这些方法在工业实践中并非没有复杂性，这既是由于生产多种工业接种菌的复杂性，也是由于随后对复杂接种菌行为的控制。从这个意义上讲，事实证明，复杂菌群（包含 2 到 6 个物种）的行为，除了呈现出可产生新的工业代谢功能的新兴特性外，还可根据组成菌群的不同物种的生态学进行预测，这使得酿酒微生物菌群的应用前景广阔。

最后，在未来，合成生物学提供了一种前景广阔的方法，可以预见，在酿酒工业的框架内，这门学科将允许重新设计当前的酵母菌株或创建全新的生物系统，以优化葡萄酒的感官质量。这些系统应将酿酒酵母的固有特性（如高发酵能力）与其他非酿酒酵母物种的特性结合起来。这将产生嵌合菌株，它们在芳香生产方面更具多样性，但在应对当前行业挑战时仍能保持强大的发酵能力；这些挑战主要来自不断变化的气候条件（葡萄酒潜在酒精含量高、营养缺乏、酸度失衡）和消费者的需求。