I progressi nella genetica dei lieviti migliorano il profilo aromatico dei vini bianchi

I mercaptani polifunzionali, come i tioli varietali, sono fondamentali nel profilo aromatico dei vini bianchi. Questi composti, legati agli aromi tropicali ed erbacei, sono presenti nell'uva come precursori non volatili. Gli enzimi del lievito durante la fermentazione rilasciano la frazione volatile, creando gli aromi associati. Fattori come la varietà dell'uva, le pratiche viticole e le condizioni ambientali influenzano direttamente la disponibilità di questi precursori e la loro trasformazione in aromi volatili durante la vinificazione. Il metabolismo del lievito, in particolare la sua capacità di internalizzare ed elaborare questi precursori, è fondamentale per determinare il contenuto finale di tioli nel vino. Le variazioni genetiche tra i lieviti e le differenze nelle pratiche di vinificazione possono aumentare o limitare il rilascio di questi composti aromatici. Le strategie biotecnologiche, come la selezione di ceppi con tratti genetici specifici o la loro modifica attraverso tecniche di miglioramento genetico, si sono dimostrate efficaci per aumentare le concentrazioni di tioli nei vini. Inoltre, l'utilizzo di consorzi microbici e di nuove tecnologie come la biologia sintetica offrono prospettive promettenti per migliorare la produzione di tioli mantenendo un equilibrio ottimale tra capacità fermentativa e generazione di aromi. Poiché l'industria deve affrontare sfide come il cambiamento climatico e i cambiamenti nelle preferenze dei consumatori, lo sviluppo di queste soluzioni innovative promette miglioramenti significativi nella qualità sensoriale dei vini.

I mercaptani polifunzionali sono composti aromatici solforati che giocano un ruolo chiave nella differenziazione sensoriale dei vini, soprattutto bianchi, in particolare quelli prodotti da varietà come il Sauvignon Blanc, il Semillon o il Verdejo. Tra questi, i tioli varietali contribuiscono in modo significativo alla qualità aromatica dei vini, fornendo caratteristici aromi di frutta tropicale ed erbacei, rendendoli uno degli aspetti più studiati della chimica del vino negli ultimi decenni. Nonostante i progressi nella comprensione delle basi genetiche e metaboliche della sintesi dei precursori dei tioli varietali nella vite e del loro rilascio da parte dei lieviti, molte domande rimangono senza risposta. L'identificazione dei geni responsabili della produzione dei precursori tiolici nella vite e la regolazione della loro espressione in risposta a diversi stimoli ambientali sono aree che richiedono ulteriori ricerche. Inoltre, la comprensione delle variazioni genetiche tra le diverse varietà di uva potrebbe offrire nuovi strumenti per la selezione di cultivar con un maggiore potenziale per la produzione di vini aromatici ricchi di tioli.

I principali composti che formano la frazione varietale tiolica dei vini sono il 4MSP (4-metil-4-solfanil-pentan-2-one), il 3MH (3-mercaptoesan-1-olo) e il suo derivato acetilato, il 3MHA (3-mercaptoesil acetato), che, grazie alla loro bassa soglia di percezione, hanno un impatto sensoriale significativo sul profilo aromatico del vino. Questi tioli non si trovano nell'uva nella loro forma volatile, ma sono presenti come precursori coniugati con aminoacidi o oligopeptidi (principalmente cisteina e glutatione) che richiedono l'azione degli enzimi del lievito durante la fermentazione per rilasciare i composti volatili responsabili dell'aroma. Tuttavia, il rilascio di tioli non dipende solo dalla capacità enzimatica del lievito, ma è anche influenzato dalla quantità e dalla disponibilità di precursori nel mosto d'uva. La disponibilità di questi precursori dipende dalla varietà di uva, dalle pratiche viticole e dalle condizioni ambientali, oltre che da fattori biotici come l'infezione da Botrytis cinerea. Questi stimoli possono indurre l'espressione di alcuni geni, aumentando l'accumulo di precursori tiolici negli acini e influenzando direttamente la capacità del lievito di rilasciare tioli durante la fermentazione.

Il processo di rilascio dei tioli durante la fermentazione dipende da lieviti in grado di internalizzare i loro precursori e di esprimere enzimi β-liasi che rompono i coniugati di cisteina e glutatione, rilasciando i tioli volatili responsabili dell'aroma del vino. Oltre a S. cerevisiae, altre specie di lievito possono rilasciare tioli e si sono rivelate strumenti utili per aumentare la concentrazione di questi composti nel vino, sia grazie a varianti genetiche dei geni coinvolti o a una diversa regolazione trascrizionale rispetto a S. cerevisiae, sia innescando processi di interazione interspecifica che determinano effetti sinergici tra i lieviti attivi durante la fermentazione. Tuttavia, è stato osservato che, sebbene i lieviti possano rilasciare tioli, solo una piccola frazione dei precursori presenti nel mosto viene effettivamente trasformata in composti volatili. Ciò è in parte dovuto alla complessa regolazione dell'espressione genica coinvolta nell'internalizzazione dei tioli e nel loro successivo rilascio nei lieviti, evidenziando la necessità di continuare a comprendere le basi molecolari del rilascio dei tioli nella vinificazione per sviluppare strumenti microbiologici o itinerari enologici che ne massimizzino il rilascio.

Il contenuto finale di tioli nel vino dipende inizialmente dalla presenza e dalla concentrazione dei loro precursori nel mosto, ma anche il metabolismo dei lieviti durante la fermentazione è un aspetto chiave nel rilascio degli aromi tiolici. I lieviti, sia S. cerevisiae che altre specie non-Saccharomyces, internalizzano i precursori tiolici e li idrolizzano enzimaticamente, utilizzando l'ammonio e il piruvato derivati per il loro metabolismo e rilasciando la frazione volatile del precursore come tioli liberi. In S. cerevisiae, i geni coinvolti in questo processo sono noti. I precursori tiolici vengono internalizzati attraverso trasportatori generali di aminoacidi e oligopeptidi. OPT1 è descritto come il principale trasportatore di precursori glutationilati, mentre il trasportatore generale di aminoacidi GAP1 è responsabile della maggior parte dell'internalizzazione dei precursori cisteinilati. Una volta nel citoplasma, gli enzimi ad attività β-liasica rompono il legame C-S dei precursori cisteinilati. I geni BNA3, CYS3, GLO1 e soprattutto IRC7 codificano gli enzimi responsabili del rilascio di 4MSP da Cys-4MSP. D'altra parte, il gene STR3 è stato identificato come responsabile del rilascio di 3SH da Cys-3SH, sebbene la sua specificità per questo substrato sia bassa. Per quanto riguarda i precursori glutationilati, una volta internalizzati, si trasformano in precursori cisteinilati attraverso un complesso percorso vacuolare che coinvolge trasportatori vacuolari ed enzimi codificati da geni come DUG1, DUG2, DUG3, ECM38, tra gli altri, per poi seguire percorsi di idrolisi catalizzati da enzimi ad attività β-liasica. Per quanto riguarda il tiolo 3SHA, il derivato acetilato di 3SH, la sua formazione da 3SH è catalizzata dall'enzima codificato dal gene ATF1.

La conoscenza dei determinanti genetici della produzione di tioli nei lieviti ha spinto a esplorare varianti genetiche nei geni coinvolti in questo metabolismo, in particolare in IRC7. Sono state descritte due varianti alleliche di questo gene in S. cerevisiae: una variante completa (IRC7F) e un'altra con una delezione di 38 bp (IRC7S). Questa delezione altera l'open reading frame, generando un codone di stop precoce che produce un enzima più corto con una minore attività catalitica. Gli studi hanno confermato che i ceppi di S. cerevisiae omozigoti per l'allele IRC7S presentano una ridotta attività della β-liasi, con conseguente scarsa o nulla produzione di tiolo 4MSP. Inoltre, entrambi gli studi hanno dimostrato che la maggior parte dei ceppi di S. cerevisiae sono omozigoti per l'allele IRC7S cancellato. Questa situazione un po' controintuitiva, in cui la variante allelica meno funzionale di IRC7 è ampiamente distribuita nei ceppi di vino, è stata spiegata dall'associazione dell'allele IRC7S con particolarità fenotipiche e genomiche che ne favoriscono la prevalenza negli ambienti domestici, soprattutto nel vino.

Inoltre, la delezione precedentemente descritta nel gene IRC7 non spiega completamente le differenze nell'attività enzimatica di Irc7p. Sono stati identificati diversi polimorfismi a singolo nucleotide nella sequenza IRC7 che, insieme alla lunghezza dell'allele, spiegano più accuratamente le differenze nell'attività di questo enzima e, quindi, nella capacità di rilasciare tioli tra i ceppi di S. cerevisiae. Sebbene l'impatto delle varianti genetiche nei geni trasportatori di precursori tiolici, come OPT1 o GAP1, sulla produzione di tioli non sia stato esplorato in profondità, sono state identificate diverse famiglie di trasportatori di oligopeptidi in diversi ceppi di S. cerevisiae. Queste famiglie mostrano preferenze specifiche per peptidi di diverse dimensioni (come i precursori tiolici) e potrebbero rappresentare un vantaggio adattativo in ambienti con bassa disponibilità di azoto, come il mosto d'uva. Inoltre, esistono differenze nella preferenza delle diverse specie per i diversi tipi di precursori tiolici presenti nel mosto d'uva, determinando il loro contributo diretto al profilo aromatico tiolico dei vini. Studi futuri dovrebbero determinare i determinanti genetici (varianti alleliche, variazione del numero di copie dei geni, ecc.) che giustificano la capacità delle diverse specie di trasportare precursori tiolici, nonché la loro risposta ai meccanismi di regolazione trascrizionale, fondamentali in questo processo, come la Nitrogen Catabolite Repression (NCR).

Alcuni trasportatori situati nella membrana plasmatica svolgono un ruolo essenziale nel catturare i precursori tiolici dal mezzo extracellulare (mosto d'uva) alle cellule di lievito. L'espressione dei principali geni coinvolti (OPT1 - in misura minore, OPT2- e GAP1) è regolata dalla disponibilità di nutrienti azotati nel mezzo attraverso meccanismi NCR. Questo meccanismo di regolazione dipende da fattori di trascrizione come Gat1p e Gln3p, che inducono l'espressione di geni legati al metabolismo di fonti di azoto non preferenziali. Questi fattori di trascrizione sono regolati dalla proteina Ure2p, attiva in condizioni di disponibilità di fonti azotate preferenziali (cioè ammonio e alcuni aminoacidi come la glutammina) e la cui presenza blocca l'azione di Gat1p e Gln3p, inibendo la trascrizione di geni che codificano trasportatori ed enzimi coinvolti nel catabolismo di fonti azotate meno preferenziali, come aminoacidi e oligopeptidi coniugati con aromi tiolici. Quando la disponibilità di fonti di azoto preferenziali diminuisce, Gln3p e Gat1p vengono rilasciati e traslocano nel nucleo, attivando l'espressione di geni per il metabolismo di fonti di azoto alternative. Inoltre, IRC7, il principale gene responsabile della produzione di enzimi ad attività β-liasica sui precursori di 4-MSP, è regolato da NCR e la sua espressione è inibita in condizioni di elevata disponibilità di fonti azotate preferenziali nel mosto. Inoltre, in questo caso, anche la disponibilità di zolfo e rame nel terreno di coltura gioca un ruolo cruciale nella regolazione dell'espressione di enzimi ad attività β-liasica, come CYS3, la cui espressione aumenta in condizioni di carenza di zolfo, o IRC7, la cui espressione diminuisce in presenza di elevate concentrazioni di rame. È da notare che i livelli di espressione genica, oltre a rispondere a fattori ambientali, variano tra i ceppi di lievito, il che, insieme all'esistenza di varianti alleliche, può spiegare la diversa capacità di ceppi o specie di rilasciare tioli durante la fermentazione. Inoltre, i diversi ceppi di lievito mostrano una diversa sensibilità ai meccanismi NCR, un aspetto chiave per spiegare i diversi livelli di rilascio di tioli volatili tra i ceppi.

Negli ultimi due decenni sono stati descritti i meccanismi molecolari che determinano il rilascio di composti tiolici nelle fermentazioni vinicole e sono stati definiti gli aspetti chiave per la bioprospezione di ceppi di S. cerevisiae con caratteristiche enologiche ottimali, sfruttando la diversità naturale della specie. Grazie alle conoscenze sopra esposte, attualmente esistono ceppi di lievito con un'elevata capacità di rilascio di tioli varietali nei vini e sono note alcune strategie enologiche necessarie per massimizzarla (ad esempio, l'ottimizzazione della nutrizione azotata). Tuttavia, la biotecnologia microbica ha introdotto strumenti alternativi che possono contribuire a migliorare l'efficienza di questo processo. Questi includono l'uso dell'ingegneria genetica, dei consorzi microbici o della biologia sintetica come strumenti chiave per migliorare la produzione di composti aromatici tiolici.

L'uso delle tecniche di ingegneria genetica è regolato da normative specifiche che ne limitano l'applicazione industriale, anche se, a livello sperimentale, sono state sviluppate decine di mutanti per comprendere meglio i determinanti genetici del rilascio di tiolo. Il primo lavoro che ha utilizzato l'ingegneria genetica per aumentare il rilascio di tiolo nei vini ha introdotto il gene tnaA del batterio Escherichia coli, che codifica una triptofanasi con attività di cistationina β-liasi, in S. cerevisiae in due modi diversi: integrandolo nel genoma del lievito e come plasmide multicopia (extracromosomico). I risultati hanno mostrato che l'integrazione del genoma ha aumentato la produzione dei tioli volatili 4MSP e 3SH in concentrazioni fino a 25 volte superiori rispetto ai ceppi non modificati e superiori a quelle ottenute con plasmidi multicopia, evidenziando l'importanza della stabilità e dell'espressione del gene nell'attività enzimatica per il rilascio dei tioli.

In lavori successivi, è stato utilizzato un approccio simile per inserire tnaA, ma questa volta accompagnato da geni di S. cerevisiae coinvolti nel metabolismo del glutatione, come GSH1 (glutatione sintasi) e GTT1 (glutatione S-transferasi), per aumentare il metabolismo del glutatione del lievito. Pertanto, la combinazione di entrambi i geni con tnaA ha moltiplicato la produzione di 3SH per 10 rispetto al ceppo che portava solo il gene tnaA. Inoltre, nel 21° secolo sono state sviluppate tecniche di clonazione estremamente versatili ed efficaci. Anche strumenti di editing genico come CRISPR-Cas9 (e simili) sono stati utilizzati per l'editing genetico di S. cerevisiae. Ad esempio, sono stati generati mutanti per aumentare la produzione di 3SH introducendo il gene tnaA. In questo caso, l'introduzione del gene tnaA aumenta naturalmente l'attività dei geni nativi che codificano le acetiltransferasi ATF1 e ATF2, enzimi che trasformano il 3SH nel suo derivato acetilato, il 3-SHA. Questi ceppi hanno raggiunto concentrazioni finali fino a 7.000 ng/L di 3-SHA nel Sauvignon Blanc (100 volte di più rispetto alla fermentazione di controllo), intensificando il profilo aromatico del vino.

Tuttavia, altre tecniche, come la mutagenesi casuale combinata con approcci di genetica classica, hanno permesso di sviluppare ceppi con caratteristiche ottimizzate compatibili con le loro applicazioni industriali e conformi alle normative e ai requisiti industriali attuali. In relazione a questi approcci, gli studi che utilizzano la riproduzione molecolare, un metodo che combina la riproduzione sessuale e la ricombinazione tra ceppi commerciali di S. cerevisiae e ceppi portatori di mutazioni specifiche (come nel gene URE2), hanno ottenuto risultati promettenti nell'aumento della produzione di tiolo. Incrociando ceppi con mutazioni benefiche nel gene URE2, ma con una bassa idoneità enologica, con ceppi commerciali, seguiti da un reincrocio della loro progenie con il genitore commerciale per quattro generazioni, sono stati generati ceppi di S. cerevisiae che hanno mantenuto le caratteristiche tecnologiche ottimali del ceppo commerciale, pur portando la mutazione del gene URE2 dal ceppo non commerciale. Ciò ha aumentato la concentrazione di tiolo volatile da 2 a 7 volte rispetto alla fermentazione di controllo.

D'altra parte, anche l'uso di ceppi selezionati di diverse specie non-Saccharomyces ha mostrato risultati rilevanti nella produzione di tiolo nelle fermentazioni vinicole. Specie come Metschnikowia pulcherrima e Torulaspora delbrueckii si distinguono per la loro capacità di rilasciare 3SH e il suo derivato acetilato, a seconda del ceppo e delle condizioni di fermentazione. Diversi studi hanno dimostrato che il loro utilizzo in fermentazioni sequenziali con S. cerevisiae aumenta il rilascio di tioli. Recentemente è stato descritto anche il ruolo positivo di Lachancea thermotolerans nel rilascio di tioli, dovuto a una maggiore capacità di consumare e trasformare i precursori tiolici, in particolare il 3-SH dal suo precursore glutationilato.

In questa linea, è degna di nota la progettazione di consorzi microbici complessi (con più specie) che sfruttano diverse caratteristiche di S. cerevisiae e di specie non-Saccharomyces per ottimizzare il rilascio di composti aromatici mantenendo un'adeguata cinetica di fermentazione. Combinando cinque specie diverse: M. pulcherrima e T. delbrueckii per aumentare il rilascio di tioli, Hanseniaspora uvarum e Candida zemplinina per ritardare la crescita di S. cerevisiae e quindi favorire l'azione delle prime due e S. cerevisiae per completare adeguatamente il processo di fermentazione. Questi approcci non sono privi di complicazioni nella loro pratica industriale, sia per la complessità di produrre inoculi industriali di più specie sia per il successivo controllo del complesso comportamento degli inoculi. In questo senso, è stato dimostrato che il comportamento di consorzi complessi (contenenti da 2 a 6 specie), oltre a presentare proprietà emergenti che possono portare a nuove funzioni metaboliche di interesse industriale, è prevedibile in base all'ecologia delle diverse specie che fanno parte del consorzio, rendendo promettente l'uso dei consorzi microbici in enologia.

Infine, in futuro, la biologia sintetica offre un approccio promettente e si può prevedere che questa disciplina consentirà, nell'ambito dell'industria enologica, di riprogettare gli attuali ceppi di lievito o di creare sistemi biologici completamente nuovi per ottimizzare la qualità sensoriale del vino. Questi sistemi dovrebbero combinare le caratteristiche intrinseche di S. cerevisiae, come la sua elevata capacità fermentativa, con quelle di altre specie non-Saccharomyces che, grazie al loro metabolismo e all'ampio repertorio enzimatico, aumentano la complessità sensoriale del vino. Questo genererà ceppi chimerici, più versatili nella produzione di aromi, ma che mantengono un profilo fermentativo robusto contro le attuali sfide dell'industria; sfide che derivano principalmente dalle mutevoli condizioni climatiche (vini con alti livelli potenziali di alcol, carenti di nutrienti e con squilibri di acidità) e dalle richieste dei consumatori.