Исследование: риск порчи вином дрожжами Brettanomyces зависит не только от их присутствия

Согласно исследованию, опубликованному в понедельник в журнале OENO One, дрожжи Brettanomyces bruxellensis, вызывающие порчу вина, реагируют на стрессовые условия в винодельческом погребе неоднозначно. Их рост и способность образовывать летучие фенолы менялись в зависимости от температуры, pH, содержания предшественников и самого штамма. Это указывает на то, что риск порчи определяется сочетанием нескольких факторов, а не одним лишь присутствием дрожжей.

Авторы исследования — Пол Боден, Сомая Сашо, Орели Ролан, Кароль Камараса и Фабьен Ремиз — изучили, как три распространённых фактора виноделия влияют на поведение B. bruxellensis в синтетическом вине: температуру, pH и концентрацию п-кумаровой кислоты — соединения виноградного происхождения, которое дрожжи могут преобразовывать в летучие фенолы. Эти фенолы, особенно 4-этилфенол и 4-этилгваякол, связаны с посторонними ароматами, из-за которых вино может пахнуть лекарствами, кожей, дымом или конюшней.

B. bruxellensis — одни из наиболее известных дрожжей, вызывающих порчу вина: они способны выживать в резервуарах, бочках, клапанах и других труднодоступных для очистки местах на винодельне. Закрепившись, они могут изменить свойства вина во время выдержки или хранения и снизить его коммерческую ценность. Новое исследование уточняет давно знакомую производителям проблему: условия, замедляющие рост дрожжей, не всегда останавливают метаболические процессы, приводящие к сенсорным дефектам.

Исследователи работали с тремя штаммами, отобранными с учётом различий в их генетическом фоне и способности производить летучие фенолы. Штаммы 2OT13_02, L0463 и 1961-Mx-M1 E2 выращивали в синтетическом вине при 20°C и 28°C, используя разные концентрации п-кумаровой кислоты. В отдельной серии опытов штамм 2OT13_02 также подвергали воздействию pH 3.3 и pH 5.6 при более широком диапазоне концентраций п-кумаровой кислоты. Численность клеток и их жизнеспособность отслеживали методом проточной цитометрии, а химические соединения измеряли с помощью LC-UV-MS/MS.

Авторы сообщили, что выбрали эти условия, чтобы создать заметные различия и лучше понять лежащие в основе результатов физиологические процессы, а не для точного воспроизведения всех условий на винодельне. Они также отметили, что температуру 28°C использовали как модель тёплых периодов, которые могут возникать во время брожения красного вина или вскоре после него, а не как типичные условия длительной выдержки.

Температура существенно влияла на выживаемость и рост дрожжей, но по-разному для разных штаммов. Согласно аннотации исследования, самая высокая из проверенных температур — 28°C — резко снижала рост и жизнеспособность, причём эффект зависел от штамма. Штамм 1961-Mx-M1 E2 почти не рос при этой температуре, а уровень гибели клеток был близок к 100%; у штамма 2OT13_02 метаболическая активность оставалась самой высокой из трёх.

Подробные данные о росте, приведённые в статье, подтверждают ту же закономерность. У штамма 2OT13_02 максимальная удельная скорость роста без добавления п-кумаровой кислоты снизилась с 0.32 в сутки при 20°C до 0.19 в сутки при 28°C. У штамма L0463 она упала с 0.27 до 0.18, а лаг-фаза увеличилась на 211 часов. При концентрации п-кумаровой кислоты 170 µM скорость роста штаммов 2OT13_02 и L0463 снизилась с 0.30 и 0.26 при 20°C до 0.11 и 0.10 при 28°C. Лаг-фаза также увеличилась на 21 и 282 часа соответственно. При концентрации п-кумаровой кислоты 370 µM скорость роста при 28°C снизилась ещё сильнее — до 0.10 у штамма 2OT13_02 и 0.05 у L0463.

При 20°C все три штамма потребляли почти всю п-кумаровую кислоту, однако преобразовывали её по-разному. Два штамма — 2OT13_02 и 1961-Mx-M1 E2 — производили преимущественно 4-этилфенол. Штамм L0463, напротив, накапливал и 4-винилфенол, и 4-этилфенол. Это важно, поскольку превращение п-кумаровой кислоты в конечные соединения, вызывающие порчу, включает как минимум два этапа. Изменение на одном из них может повлиять не только на степень порчи, но и на соотношение соединений, остающихся в вине.

При повышении температуры, как выяснили исследователи, 4-этилфенола образовывалось меньше, а 4-винилфенола — больше. По словам авторов, эта закономерность указывает на ограничение восстановительной стадии, на которой винилфенол превращается в этилфенол в стрессовых условиях. Иными словами, тепло не просто снижало общую активность — оно, по-видимому, меняло ход метаболического пути.

Опыты с pH выявили ещё один аспект этой сложности. При pH 5.6 дрожжи потребляли меньше п-кумаровой кислоты, чем при pH 3.3, однако более высокий pH также предотвращал метаболическую блокировку, наблюдавшуюся при высоких концентрациях п-кумаровой кислоты в более кислой среде. В статье этот эффект связывают с тем, как pH меняет степень ионизации гидроксикоричных кислот и их взаимодействие с клеточной мембраной. Результаты показывают, что кислотный стресс может влиять как на выживаемость дрожжей, так и на итоговый химический профиль порчи.

Этот вопрос напрямую связан с обычными средствами контроля на винодельне. На практике pH играет ключевую роль в обеспечении микробиологической стабильности, поскольку от него зависит эффективность диоксида серы — одного из основных средств защиты от Brettanomyces. Новые результаты указывают на то, что pH может также непосредственно влиять на путь образования соединений, вызывающих порчу, меняя то, как дрожжи перерабатывают кислоты-предшественники в винной среде.

Главный вывод статьи состоит в том, что одного лишь наличия предшественников недостаточно, чтобы предсказать риск образования летучих фенолов. В вине могут присутствовать необходимые соединения виноградного происхождения, однако итог зависит также от особенностей штамма, кислотности и температуры. Для виноделен и других производителей напитков, работающих с выдерживаемой в бочках или ферментированной продукцией, это может помочь усовершенствовать контроль качества: исследование указывает на периоды, когда сочетание высокой температуры, химических свойств среды и микробного разнообразия способно повысить вероятность появления посторонних вкусов и ароматов. Однако исследование проводилось на синтетическом вине, поэтому любые изменения в коммерческом производстве необходимо будет проверить в реальных условиях погреба.

Авторы рассматривают эту работу как часть более широких усилий по развитию нехимических методов контроля и оценки рисков. Сегодня основными средствами остаются соблюдение гигиены, контроль уровня диоксида серы и, при необходимости, такие обработки, как применение хитозана и диметилдикарбоната или физическая стабилизация. Однако эти методы не одинаково эффективны для разных вин. В статье предполагается, что часть различий в результатах может объясняться особенностями поведения штаммов и сочетаниями стрессовых факторов, которые часто упускают из виду.